東大ら、抗原との結合で蛍光量が顕著に増大する抗体の作成に成功

　

　東京大学は、北陸先端科学技術大学院大学(JAIST)と共同で、抗原に結合することにより蛍光が顕著に増大する抗体の作成に成功したと発表した。抗体の末端近傍をある種の色素で蛍光ラベルした組み換え抗体断片を作ることで、単体では抗体内のアミノ酸によって消光されている蛍光の量が増大する現象を発見したというわけだ。東京大学大学院工学系研究科の上田宏准教授、北陸先端科学大学院大学の芳坂貴弘教授、プロテイン・エクスプレスの阿部亮二研究員らによる研究で、成果は10月6日に「Journal of the American Chemical Society 」オンライン版に掲載された。

　各種の抗原を得意敵に認識できる抗体は、生体内外を問わずに生物学の基礎研究から病気の診断・治療まで、さまざまな場面で幅広く用いられている。検出・診断分野において抗体を利用する「免疫測定」もその有用性から年々増加しているが、これまでの免疫測定法ではその実施に手間と時間がかかってしまう問題があった。また、測定対象が低分子とタンパク質のような高分子の場合とでは、測定原理を変更しなければならなかったりもする。特に、サンプル溶液中(均一系)で抗体の各種抗原との結合を勘弁迅速に調べられる汎用的な検出方法がなく、求められていたというわけだ。

　研究グループでは、アミノ末端近傍の1カ所を「無細胞タンパク質合成系」と、「ピンポイント標識技術」を用いて、「蛍光色ローダミン」で標識した低分子抗体「Q-body」(Quenchbody)を作成。なお、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内のタンパク質合成因子を試験管内で再構成し、合成反応を行わせる系のこと。任意の因子を加えられることから、生体内では合成が困難な非天然因子標識タンパク質の合成に適している。また、ピンポイント標識技術とは、無細胞タンパク質合成系に、「アンチコドン」として「アンバーコドン」などを持ち非天然アミノ酸が結合された「アミノアシルtRNA」を加え、タンパク質の任意の部位に非天然アミノ酸を導入することができる技術のことだ。

　そして、抗原非存在下ではほぼすべての抗体内部に存在するアミノ酸「トリプトファン」により、ローダミンの蛍光が消光(クエンチ)され、抗原が結合するに伴ってその消光が解除されて蛍光強度が顕著に増大するという新奇な現象を見いだしたのである。なお、クエンチは周囲の環境の変化やほかの分子の接近などによる蛍光色素の蛍光が減少する現象だ。Q-bodyは、タンパク質中のトリプトファンの電子移動による消光を利用したタイプ。

　抗体の抗原結合部位近傍には、ほとんどの場合4個以上のトリプトファンが存在し、これらの多くは抗原が結合していない場合にのみ色素と接触しうる内部に位置している。実際、この方法でQ-bodyを作製したところ、骨粗鬆症などのマーカー分子である「オステオカルシン」、内分泌攪乱作用が懸念される「ビスフェノールA」、麻薬であるモルヒネ・ヘロイン類などの低分子、「リゾチーム」や「血清アルブミン」のようなタンパク質など、多くの抗原を混ぜるだけで高感度に定量できることが判明した。さらに、オステオカルシンについては50%血漿中においてもほぼ同じ感度で測定できることを確認。共存物質による影響も少ないことが分かったのである。

　これまで、抗体の抗原結合部位近傍を特殊な蛍光色素である「環境応答性色素」で標識し、タンパク抗原の結合を検出した例はいくつか報告されてきた。しかし、その標識部位は試行錯誤によって決定する必要があり、また低分子の検出に応用された例は今のところない。今回、ほぼ同一の標識法によって多種類の抗原検出が可能になったことから、今回の手法はより汎用的な「その場で抗原が検出可能なタンパク質」として診断素子としての実用化にも適していると考えられている。

　免疫測定法としての今回手法の利点としては、洗浄工程が不要で、少量のサンプルと混合して蛍光強度を測定するだけで、測定が完了する極めて簡便な診断技術である点が1つ。2つ目は、抗体中に存在する保存性の高いトリプトファンを利用するため、抗体の種類を変えれば種々の物質の検出にも広く適用が可能な点で汎用性に優れていること。3つ目は、低分子化合物、ペプチド、高分子タンパク質といった多種類の抗原に対して適用可能であることとなっている。

　これにより、今後基礎研究分野のみならず、インフルエンザなどの感染症や各種疾患の臨床検査分野、抗癌剤などの血中薬物濃度をベッドサイドでモニタリングする医療分野、生物・化学テロ防止や覚せい剤検出といった安心/安全分野、水質・大気調査、残留農薬検査などの分野で利用されることが期待されているとした。

　画像1。抗原が結合することで抗体の構造が変化してより安定となり、クエンチ状態から蛍光量が増大する仕組みをイメージ化したもの