体内時計の乱れの治療に道

　

　理化学研究所(理研)は10月19日、リン酸化/脱リン酸化といった可逆的なタンパク質の修飾から自律振動子を作る仕組みの一端を解明したと発表した。同成果は、理研生命システム研究センター 合成生物学研究グループの上田泰己 グループディレクター、大出晃士 特別研究員、理研発生・再生科学研究センター システムバイオロジー研究プロジェクトのCraig C. Jolley 国際特別研究員らによるもので、米国の科学雑誌「Cell Reports」オンライン版に掲載された。

　生物が示す多くの現象は周期性を持っている。例えば、ヒトが目を覚ましたり眠りに落ちたりするサイクルはおおよそ24時間周期で生じるし、カエルの受精卵はおおよそ30分ごとに細胞分裂を繰り返す。こうした周期的な振る舞い(振動)を引き起こす元となるシステムを「自律振動子」と呼び、これまで細胞内でどのような因子がどのような仕組みで働き、自律振動子を形成しているのかについて、多くの研究が行われてきた。特に、ヒトの1日周期で生じる生理現象に関与する概日時計の研究は盛んに進められており、概日時計を駆動する遺伝子・タンパク質がさまざまな生物種で同定されるに至り、それらがどのようにして自律振動子を形成するかについても、大きく分けて2つの仕組みが考えられるようになっている。

　1つ目の仕組みは、遺伝子の転写ネットワークに基づいた、転写因子の負のフィードバック制御によるもの。これについては、数理モデルによる定量的な理解が進んでおり、研究グループも2011年に、この仕組みが哺乳類の概日時計に重要な役割を果たすことを実際に細胞を用いた実験で示していた。

　2つ目は、タンパク質の可逆的な翻訳後修飾によるもので、化学修飾を触媒する酵素と修飾を受ける基質の組み合わせにより、基質の修飾状態(基質が修飾されたり、脱修飾されたり)が時間とともに変動することで機能するというものだ。シアノバクテリアの概日時計は、この仕組みに基づいており、その機能を担うタンパク質は、多くの基質や酵素にはないいくつか特徴的な性質があるため、一般的な酵素や基質を用いたタンパク質修飾に基づく自律振動子が作れるのか、また、そのために必要な最低条件が何かについては十分に理解されていなかった。

　そこで、研究グループは今回、一般的な酵素と基質の反応機構を用いた数理モデルの解析を行い、タンパク質修飾に基づく振動子を作るために必要な条件の検討を行った。

　まず、自律振動子を形成するために最低限必要なタンパク質として、修飾酵素、脱修飾酵素、基質をそれぞれ1種類、計3種類のタンパク質だけを対象にした。次に、酵素反応の速度を記述するとき、最も一般的に用いられている「ミカエリス・メンテン式」にしたがって修飾/脱修飾反応が起こると想定した。

　ミカエリス-メンテン式とその反応機構の模式図。修飾酵素Eが、基質(S)を修飾基質(S-P)に変換する酵素反応を触媒すると想定。ここでは、細胞内でよくみられるリン酸化を想定して修飾をP(リン酸:Phosphate)で表している。このプロセスでは、基質と修飾酵素が1:1で結合し、酵素基質複合体(ES)を作り、その後修飾基質が生成すると考える。基質酵素の結合定数をkb、基質酵素の解離定数をkub、基質酵素複合体から基質が修飾される反応速度定数をkとして、基質酵素の結合と解離が、反応速度よりも十分に早いとき、修飾基質が作られる速さは、下段の式で近似される。kは酵素が修飾・脱修飾を受ける速度、Km=(kub＋k)/kbは酵素-基質の親和性のそれぞれの指標となる定数

　この反応メカニズムでは、酵素と基質が結合する強さ(親和性)と基質が酵素によって修飾・脱修飾を受ける速さ(反応速度)の2つの要素で酵素反応の進行を表すことができる。コンピュータを用いてこの2つの要素をさまざまに変更したときの基質修飾状態の時間変化をシミュレートしたところ、基質タンパク質の2カ所以上が修飾を受けると、修飾状態が振動する場合があることが発見された。

　基質の2カ所が修飾を受ける場合に生じる周期的な基質修飾状態の変化。基質の2カ所が修飾酵素と脱修飾酵素によって可逆的修飾を受けると想定。この時、基質の修飾状態は4通りある(修飾を受けていないS00、片方のみ修飾されたS01とS10、両方修飾されたS11)。基質の修飾状態によって、修飾反応(緑線)と脱修飾反応(青線)は異なる酵素-基質親和性Kmと反応速度kで生じるとするこのモデルでは、各ステップのKmとk値の組み合わせによって、基質状態が時間とともに周期的に変化する場合がある。

　このとき、振動する場合と振動しない場合の違いを調べるため、12億通りの親和性と反応速度の組み合わせをコンピュータでシミュレーションし、どの組み合わせで振動が生まれるのかを調べたところ、振動を作る組み合わせには、2つの特徴があることが判明した。1つは、対となる速度の速い修飾反応・脱修飾反応の方向の向きがそろっていること、2つ目は特定の修飾状態の基質が酵素と強く結合することである。

　 修飾状態の振動を作る親和性と反応速度の特徴。振動を作る親和性と反応速度の組み合わせを12億通り解析することで見いだされた2つの特徴。より速い傾向にあった反応速度を太線で、遅い傾向にあった反応速度を点線で表し、酵素と基質の親和性が高い状態には、それぞれ修飾・脱修飾酵素を表示している。1つの特徴として、対となる速度の速い修飾反応・脱修飾反応の方向の向きが揃っていることがあげられる。つまり右回りの反応速度が、左回りの反応速度よりも早い。2つ目の特徴として、特定の修飾状態の基質が酵素と高い親和性があることで、次の反応ステップを阻害する(T字マーク)ことが挙げられる

　この際、基質1つひとつの修飾状態に時間的な差が生じることあり、”遅れた修飾状態”の基質と酵素との親和性が高い場合には、”進んだ修飾状態”の基質が次の修飾状態になるために必要な酵素まで奪い取ることになる。

　そして、すべての基質が同じ修飾状態になってはじめて、すべての基質はいっせいに次の修飾状態に進むことができる。これにより、時間とともに修飾状態が一斉に変動する自律振動子が形成されるという仕組みが考えられるという。

　基質集団の修飾状態の同調の模式図。振動が生じるためには、基質集団の修飾状態が時間ごとにそろう必要がある。今、基質修飾状態がS01とS11に分散しているとする。右回りの反応速度が高いために、S01は修飾されS11になる傾向にある。S11は脱修飾を受け、S10になる傾向が強いが、脱修飾酵素はS01と強く結合しており、S11の脱修飾反応を触媒することができない。したがって、S01はS11に修飾されるが、S11は次の修飾状態(S10)に進むことができない。ほぼすべてのS01がS11に変換されたときに、脱修飾酵素はS01から解放され、S11を脱修飾する。こうして、S01とS11に分散されていた基質集団がS11にそろう

　実際に、遅れた基質が次の修飾状態に進む速度を遅くすると、基質集団の足並みがそろうまでに時間がかかり振動の周期が長くなることが確認された。

　酵素と強く結合する基質を消費する反応ステップが振動の周期決定に重要となる。図はS01からS11に至る反応速度k3を変化させた場合の振動の様子。S11がS10へと進むためには脱修飾酵素FがS01から解離することが必要なほか、FがS01から解離するためにはS01がS11に変換されることによって減少する必要がある。k3はこのS01からS11への変換の速度定数であるため、k3が遅ければFは遅くS01から解離されるため、S11で停止している時間(黄色背景)が12時間から約20時間に長くなる。つまり、k3によって周期の長さ変化することが判明した

　また、2つ目の特徴である酵素と基質の親和性を低くすると、基質集団の足並みが乱れ、基質集団の同調した振動は見られなくなり、自律振動子が形成されないことも確認された。

　酵素-基質の高い親和性を無くすと、基質集団の修飾状態が分散する。酵素-基質の親和性が高い場合と、低い場合それぞれについて修飾状態の変化の計算が行われた。ここでは、基質分子の修飾状態の変遷を確率的に生じるものとして計算し、分子1つひとつを個別に計算している。親和性が高い場合(左)、それぞれの基質の修飾状態は各時間でよくそろっているが、低い場合(右)は修飾状態が分散しているのが分かる

　これらの結果から、特定の親和性の高さや反応速度を調整することで、振動の振幅や周期長を制御できることが判明したわけだ。すなわち可逆的なタンパク質の修飾から振動が生み出される原理は、基質1分子ごとが決まった順序で修飾を受けることで1分子振動子として働くこと、そして、それらの状態が基質間で揃うことで、同期した1分子振動子が基質集団としての修飾状態の自律振動を生み出すこと、ということが分かったのである。

　今回の成果で、一般的な修飾酵素、脱修飾酵素と複数の修飾箇所を持つ基質があると、振動子が形成可能なことが判明したが研究グループでは、興味深いことに、今回明らかになった振動の仕組みは、シアノバクテリア概日時計タンパク質で提唱されている仕組みとよく似ていたとコメント。基質の複数の場所が特定の酵素によって修飾を受ける例は概日時計に関わるタンパク質をはじめ、他の周期的な現象に関わるタンパク質においても数多く知られているため、タンパク質修飾に基づく振動子は、シアノバクテリア概日時計にみられるような特殊な例ではなく、他の生物種の多様な周期現象でも機能している可能性があるという。

　また、振動子形成に必要な結合の強さと反応速度のパターンが明らかになったため、振動子形成に適した酵素や基質の組み合わせを検討することができるようになることから、今後、酵素と基質の結合や、反応速度を予測し改変できるように技術が進めば、細胞内で人工的に設計したタンパク質振動子を「人工時計」として機能させ、細胞の周期的振る舞いを自在に操り、体内時計の乱れが原因となる不眠症などのリズム疾患の治療などに役立てることなどが期待されるともコメントしている。